Про компанію
ТОВ НВЛ 'Гранум' представляє новий вектор розвитку компанії. Великий вибір виробів медичного призначення є одним з основних аспектів розвитку медико-фармацевтичного ринку країни. Реалізація ВМП через аптечні мережі, магазини медтехніки та фірми національного і регіонального значення наповнює ринок вдосконаленої продукцією. Спираючись на досвід поставок медичних товарів, ТОВ НВЛ 'Гранум' забезпечує своєчасні поставки та задовольняє потреби клієнтів по всій території України.

Контакти

ТОВ «НВЛ Гранум» (відділ реалізації ВМП)

Україна, 61001, м. Харків, вул. Юр`ївська, 17

Тел.: +38 057 757-47-17

КиївСтар:  +38 067 690-57-78

МТС: +38 099 145-36-28

Пошта:  granumlab@gmail.com

Використання эритроцитарних діагностикумів для фенотипування лімфоцитів

 

Шляхова Н.В.

ГУ « Институт охраны здоровья детей и подростков АМН Украины»

 

       Не вызывает сомнения, что течение и исход многих заболеваний, различных по этиологии и патогенезу, в значительной мере обуславливается состоянием иммунной системы. Будучи многокомпонентной, она работает как единое целое, обеспечивая контроль над постоянством клеточного и гуморального состава организма, уничтожая всё генетически чужеродное или дефектное своё.

      Определение субпопуляций лимфоцитов в настоящее время приобрело реальную практическую значимость для выявления иммунной недостаточности не только при воспалительном процессе, но и при ряде других заболеваний.

      В последние десятилетия отмечается стремительный рост количества методов анализа клеток иммунной системы. И если методы выявления основных типов лейкоцитов в окрашенных мазках, предложенные Эрлихом (1891) и основы клинической интерпретации лейкоцитарной формулы, доработанные Шиллингом (1931), мало изменились, то методы оценки субпопуляций лимфоцитов бурно развиваются и в настоящее время.

       В 70-е годы началось интенсивное развитие методологии анализа популяций лимфоцитов и их функциональной активности. В те годы были предложены и развивались основные иммунологические методы: иммунофлюоресценции, бласттрансформации, розеткообразования, торможения миграции лейкоцитов и т.д.

      Импульсом для дальнейшего развития послужило создание в 80-е годы Ц. Мильштейном и Дж. Келлером гибридомной технологии получения моноклональных антител, что позволило разработать методы определения широчайшего спектра поверхностных маркеров на клетках иммунной системы с использованием моноклональных антител (МКАТ).

      Лимфоциты подразделяются на субпопуляции по наличию на их поверхности разнообразных маркеров (антигенов, рецепторов) и выполнения определенных функций. Такие поверхностные маркеры обнаруживают при помощи молекул или частиц, имеющих молекулярные структуры, комплементарные тем, которые находятся на поверхности клеток, и соединенных с  индикаторами, позволяющих установить факт их прикрепления к клетке.

      Индикаторами могут служить флуоресцирующие красители, ферменты или крупные корпускулярные частицы, хорошо видимые в микроскоп при увеличении, достаточном для идентификации клеток крови.

     В настоящее время существует несколько методов оценки субпопуляций лимфоцитов по рецепторам на поверхности клеток и их модификаций: 1) метод розеткообразования с эритроцитами барана и мыши; 2) люминесцентно-серологический метод; 3) метод лазерной проточной цитофлуориметрии; 4) тест розеткообразования с частицами, покрытыми моноклональными антителами; 5) визуальный стрептовидин-биотиновый метод; 6) метод иммуномагнитной сепарации клеток.

     В последние десятилетия широко позиционируются проточные цито-флуориметры. Безусловно, метод с использованием этих автоматических анализаторов да.т достаточно точные, контролируемые и четко воспроизводимые результаты. Однако эти автоматы и наборы реактивов к ним весьма дорогостоящие и их использование экономически оправдано и целесообразно лишь при большом потоке анализов, что делает метод проточной цитофлуорометрии недоступным для большинства иммунологических лабораторий.

      Методы мембранной флуоресценции, люминисцентно-серологический метод, использующие в качестве индикаторов флуоресцентные красители (флуоресцин или родамин), применяют для выявления иммуноглобулинов на поверхности лимфоцитов. Для проведения данного метода необходимо выделение чистой суспензии лимфоцитов с использованием градиента плотности, поскольку гранулоциты могут обладать спонтанной люминесценцией. Однако, если В- и общие Т-лимфоциты (СD 3+) имеют большую плотность антигена на поверхности клеток и для их обнаружения достаточно прямого люминисцентно-серологического метода, на мембране лимфоцитов других субпопуляций (например, СD 4 и СD 8) плотность дифференцировочного антигена мала и поэтому их выявление возможно лишь непрямым или двойным непрямым методами. Последнее предполагает использование дорогостоящих высокоспецифичных моноспецифичных сывороток, меченых флюорохромом и делает качественное проведение данного метода технически сложным (в т.ч. и из-за необходимости постановки многочисленных контролей для исключения ошибок, связанных с неспецифическим свечением клеток).

      Метод розеткообразования (РО) одним из первых получил распространение в клинической иммунологии с начала 70-х годов (Bach, 1973) и сегодня не потерял своей значимости, хотя, несомненно, уступает по своей точности методам, основанным на использовании моноклональных антител. Методы розеткообразования основаны на феномене прилипания к поверхности клеток достаточно крупных корпускулярных частиц с образованием розеток. Акт прилипания осуществляется за счет неспецифических сил адгезии, однако обуславливается взаимодействием комплементарных структур.

     Самыми простыми являются тесты, в которых в качестве индикаторных частиц используются эритроциты животных. Тест розеткообразоания с эритроцитами барана (Е-РОК) применяют для обнаружения Т-лимфоцитов. Данный метод позволяет выявить Е-рецептор, идентичный СD2+антигену, выявляемому с помощью МКАТ и присутствующему на зрелых Т-лимфоцитах и части NК-клеток.

      Для выявления В-лимфоцитов используют тест РО с эритроцитами мыши (М-РОК), т.к. на их поверхности в больших количествах присутствуют М-рецепторы. Кроме того, для выявления иммуноглобулинов и рецептора к третьему компоненту комплемента на поверхности В-лимфоцитов используют эритроциты, нагруженные антителами к иммуноглобулинам человека (метод антиглобулинового РО) или антителами и комплементом (ЕАС-РО). Недостатком данных методов при использовании эритроцитов барана является возможность спонтанного Е-РО, что приводит к увеличению количества В-клеток.

     Метод РО с теофиллином для выявления субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов имеет низкую точность, т.к. вдобавок к клеткам, несущим соответствующую функцию, выявляет более широкий спектр клеток, нежели прочие методы. При постановке метода накладывается уровень функциональной активности клеток, в том числе и активация цАМФ. Кроме того, у 3-5 % здоровых людей методом РО с теофиллином Т-цитотоксические клетки вообще не выявляются и в подобном случае можно лишь говорить о низком уровне Т-цитотоксических лимфоцитов и высоком значении соотношения Тх\Тц.

      Метод РО с использованием эритроцитарных диагностикумов (ЭД) можно использовать для определения самых разнообразных субпопуляций иммунокомпетентных клеток (тех же, которые определяются методами иммунофлуоресценции) и позволяет исключить неточности, присущие методу РО с эритроцитами животных. Однако, в отличие от методов лазерной проточной цитофлуорометрии и иммунофлуороресценции, не требует дорогостоящего оборудования и предполагает работу со световым микроскопом.

     Эритроцитарный диагностикум представляет собой инертные эритроциты крупного рогатого скота, покрытые моноклональными антителами РИС  1). Диагностикум НПЛ «Гранум» зарегистрирован в Украине. В нашей лаборатории данный метод был апробирован и внедрен в практику.

    Оценку субпопуляций лимфоцитов можно проводить как в капиллярной, так и венозной крови (цельной, с выделением лейко- или лимфовзвеси).

Этапы проведения:

. инкубация с эритроцитарным диагностикумом 30 мин.

. седиментация клеток (центрифугирование и холодильник – 1 час)

. фиксация

. окраска и приготовление препаратов (рис. 2).

 

 

               Рис. 1 Принцип метода РО                                  Рис. 2 РО с использованием ЭД.

                с использованием ЭД.                                         (Увеличение х100,   

                                                                                                 окраска метиловым зеленым с пиронином)

        Постановка метода достаточно проста и доступна для проведения спе-циалистам со средним образованием. Учет реакции проводится в световом микроскопе и может осуществляться как в нативных, так и в окрашенных мазках.

     Хочется отметить, что данный метод соответствует основным критериям любого метода: чувствительность, точность, надежность. Кроме того, метод достаточно прост в постановке, не требует дополнительного дорогостоящего оборудования и переподготовки сотрудников, имеет достаточно низкую себестоимость и, безусловно, заслуживает Вашего внимания.

ВОЗМОЖНЫЕ ДЕФЕКТЫ ПОСТАНОВКИ МЕТОДА РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ И ПУТИ ИХ УСТРАНЕНИЯ

 

        Поскольку иммунологические методы фенотипирования клеток основаны на взаимодействии живых клеток с разнообразными индикаторными частицами, они крайне чувствительны к изменению условий проведения реакции и малозаметные, на первый взгляд, ошибки постановки могут существенно сказаться на конечном результате. Поэтому, ниже приводятся некоторые «нюансы» методики, с которыми мы столкнулись при внедрении данного метода в нашей лаборатории. Безусловно, кроме приведенных, возможны и другие дефекты, требующие консультации специалиста. Сотрудники НПЛ «Гранум» всегда готовы оказать вам помощь при возникновении подобных ситуаций.

 

1. Клетки располагаются в препарате неравномерно, имеются когломераты.

Причина. Плохо ресуспендирован осадок. Ресуспендирование резко затрудняется, если среди выделенных лейкоцитов (лимфоцитов) будет часть разрушенных и погибших клеток, из которых выбрасываются РНК и ДНК, способствующие склеиванию живых клеток в конгломераты. Кроме того, при использовании цельной крови в результате плохого гемолиза возможно наличие большого количества человеческих эритроцитов.

Устранение. Повысить интенсивность ресуспендирования осадка. Проконтролировать точность соблюдения всех режимов постановки реакции (возможно превышение времени хранения лейкоцитарной взвеси после ее получения, качества гемолиза человеческих эритроцитов, скорости и времени ценрифугирования в процессе постановки реакции, рН используемого раствора для отмывания клеток, времени фиксации)

 

2. В препаратах достаточное количество лейкоцитов, но почти нет эритроцитов, малое содержание розеток.

Причина. Во-первых, недостаточное перемешивание ЭД перед отбором или раскапыванием в пробирки. Во-вторых, несоблюдение времени инкубации и/или температурного режима. В-третьих, окрашивание недофиксированных клеток, приводящее к лизису эритроцитов.

Устранение. Тщательное ресуспендирование ЭД перед отбором для постановки реакции и внесением в пробирки. Точное соблюдение времени инкубации и температурного режима. При наличии в препарате мембран эритроцитов вокруг лейкоцитов, отсутствии целых эритроцитов следует обратить внимание на качество фиксатора и время фиксации. Следует помнить, что глутаровый альдегид, составляющий основу фиксатора, - крайне неустойчивое вещество, быстро разрушающееся на свету. По этой причине срок хранения фиксатора ограничен (1 месяц). Кроме того, хранить фиксатор необходимо в темной посуде, а для его приготовления не использовать старый глутаровый альдегид.

 

3. В препарате мало лейкоцитов, в то время как количество эритроцитов нормальное.

Причина. Потери клеток в процессе гемолиза или хранения лизированной крови (выделенной суспензии клеток) в физиологическом растворе.

Устранение. Точно соблюдать все режимы операции при проведении гемолиза (время гемолиза, соотношение дистиллированной воды и забуференного физ. раствора (9:1)). Для сохранения жизнедеятельности клеток важнейшее значение имеет рН (7,2-7,4). Однако, на практике, дистиллированная вода чаще имеет кислую среду. Поэтому, в целях предотвращения потери клеток при отмывке, а также для приготовления фиксатора, следует использовать забуференный физ. раствор или специальные культуральные среды (Хенкса, 199).

 

4. Поле препарата забито эритроцитами, розеток очень много.

Причина. Возможно, вы не отбирали необходимое для постановки реакции количество ЭД и вскрыли весь флакон. В результате нарушения условий хранения (неплотно закрытая крышка) произошло испарение надосадочной жидкости и изменилась концентрация эритроцитов.

Устранение. Отбирать из флакона необходимое для постановки реакции количество ЭД с помощью шприца. Предварительно тщательного перемешать реактив. Это предотвратит изменение конечной концентрации эритроцитов и возможное загрязнение ЭД. Если все же данная ошибка произошла, необходимо отмыть эритроциты и приготовит взвесь заново. Обратитесь за помощью к сотрудникам научно-производственной лаборатории, окажут Вам помощь в устранении этого дефекта.

 

5. Все поле препарата забито сильно окрашенными частицами, клетки видны плохо, мало розеток.

Причина. Загрязнение большим количеством корпускулярных частиц (в.ч. и микробами) реакционных сред.

Устранение. Для постановки реакции необходимо использовать чистые, отфильтрованные растворы (отмывочного раствора, фиксатора, краски). Особенно это касается раствора краски. Контроль отсутствия нерастворившихся частиц осуществляется под микроскопом.

 

6. Окраска в препаратах слабая, нечеткая.

Причина. Плохое окрашивание препаратов.

Устранение. Качество окрашивания препаратов зависит от: качества фиксатора (см. п.п. 2,3); качества краски и времени окрашивания; отмывки окрашенного препарата водой. Если фиксатор работает хорошо, то необходимо проверить краску. Если она слабая, можно удлинить время окрашивания розеток. После окрашивания стекла необходимо хорошо промыть проточной водой для удаления излишков красителя.

 

К ВОПРОСУ О НОРМАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЯХ

 

     Проблема определения «нормы», расчета нормативных (контрольных) показателей вызывает самый пристальный интерес врачей всех специальностей. Этот вопрос важен не только с теоретической точки зрения, но прежде всего, с практической как критерий точки отсчета при оценке состояния организма и его систем.

     Следует помнить, что нормальная работа иммунной системы возможна в двух принципиально разных состояниях активности – спокойном (у клинически здорового человека) и активном – при наличии в организме воспалительного процесса. Поэтому, на наш взгляд, более информативной является оценка иммунограммы в динамике патологического процесса.

     Показатели работы иммунной системы могут существенно изменяться под влиянием разнообразных физических и эмоциональных нагрузок, стресса, биологических ритмов. Кроме того, ряд особенностей функционирования иммунной системы сопряжено с возрастными аспектами.

     Общепринятым критерием является оценка иммунограммы относительно нормативных показателей практически (клинически) здоровых лиц. В каждой лаборатории необходимо иметь свои среднегрупповые значения параметров, учитывающие региональные, возрастные особенности, а так же ме-

тодологические возможности лаборатории.

     Ниже мы приводим данные значений субпопуляций лимфоцитов для подростков 14-18 лет, полученные в нашей лаборатории и для взрослых людей среднего возраста (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2003, стрептовидинбиотиновый метод).

                                                                                                                                                                                          Таблица

Значение показателей субпопуляций лимфоцитов у подростков и взрослых людей

 

Показатель

 

14-18 лет (90 %)*

 

Взрослые (90 %)**

 

СD3+ лимфоциты, %

51-68

55-78

СD4+ лимфоциты, %

30-42

34-59

СD8+ лимфоциты, %

18-30

9-34

CD4+/ CD8+лимфоциты

1,2-2,2

1,0-2,0

СD16+ лимфоциты, %

5-26

-

CD22+ лимфоциты, %

14-26

7-24

 

Примечание. * - данные лаборатории клинической иммунологии ГУ ИОЗДП АМНУ, 2008 г.;

** - данные Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2003 г. (Москва)